UNIDAD II. TECNOLOGÍA E INSTRUMENTACIÓN.
2.1. DISEÑOS DE REACTORES BIOLÓGICOS.
El diseño de reactores biológicos o biorreactores es una tarea bastante compleja. Los microorganismos o células son capaces de realizar su función deseada con gran eficiencia bajo condiciones propicias. Las condiciones ambientales de un reactor biológico tales como flujo de gases (por ejemplo, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono, etc.), temperatura, pH, oxígeno disuelto y velocidad de agitación o circulación, deben ser cuidadosamente monitoreadas y controladas.
La mayoría de los fabricantes de reactores biológicos usan recipientes, sensores, controladores y un sistema de control interconectados para su funcionamiento en el sistema de biorreacción.
La misma propagación celular puede afectar la esterilidad y eficiencia del reactor biológico, especialmente en los intercambiadores de calor. Para evitar esto, el reactor biológico debe ser fácilmente limpiable y con acabados lo más sanitario posible.
Se requiere de un intercambiador de calor para mantener el bioproceso a temperatura constante. La fermentación biológica es una fuente importante de calor, por lo que en la mayor parte de los casos, los reactores biológicos requieren de agua de enfriamiento. Pueden ser refrigerados con una chaqueta externa o, para recipientes sumamente grandes, con serpentines internos.
En los reactores biológicos utilizados para crecer células o tejidos, el diseño es significativamente distinto al de los reactores biológicos industriales. Muchas células y tejidos, requieren una superficie u otro soporte estructural para poder crecer y los ambientes agitados son comúnmente dañinos para estos tipos de células y tejidos. Los organismos superiores también requieren medios de cultivo más complejos.
El biorreactor es la parte principal de cualquier proceso bioquímico en el que se empleansistemas microbianos fúngales o sistemas celulares mamíferos o plantas para la manufactura económica de una amplia variedad de productos biológicos útiles. La función principal de un biorreactor diseñado apropiadamente es la de proveer un medio controlado para alcanzar el crecimiento y la formación de productos óptimos, o cualquiera de ambos. El sistema celular particular empleado. A menudo, el término "fermentado" se usa enpublicaciones para referirse al "biorreactor".
El funcionamiento de cualquier biorreactor depende de muchas funciones incluyendo:
· la concentración de biomasa, la cual debe permanecer alta;
· el mantenimiento de las condiciones estériles;
· agitación efectiva para que la distribución de los substratos y
· microorganismos en el reactor sea uniforme; eliminación de calor;
· creación de las condiciones correctas de corte; las rapideces altas de corte pueden ser dañinas para el organismo pero las rapideces de corte bajas también pueden ser indeseables debido a la floculación o al crecimiento de biomasa inconvenientes sobre la pared del reactor y sobre el agitador.
Hay tres grupos de biorreactores usados actualmente para la producción industrial:
v no agitados, sin aeración (86%);
v no agitados, con aeración (11%);
v agitados, con aeración (13%).
La síntesis de la mayoría de nuevos productos requiere el crecimiento demicroorganismos en recipientes aereados con agitación.
Figura 1. Diseño de un biorreactor común.
2.2. BASES MICROBIOLÓGICAS PARA EL DISEÑO DE UN BIORREACTOR.
Las bases microbiológicas que se deben de tomar en cuenta para diseñar un biorreactor son las siguientes:
v Complejidad de la mezcla reaccionante.
v Concentraciones relativamente bajas de sustrato y productos.
v Restricción de la fase acuosa.
v Condiciones suaves de temperatura y PH.
v Incremento de la masa microbiana junto a la transformación bioquímica.
v Capacidad de los microorganismos de sintetizar sus propios catalizadores.
v
Ejemplo de microorganismos usados en un biorreactor.
2.3. CLASIFICACIÓN DE LOS REACTORES BIOLÓGICOS.
Hay tres maneras de clasificar los reactores biológicos y son las siguientes.
Clasificación Operativa: Los reactores biologicos se clasifican primeramente de acuerdo al modo de operación: discontinuo, semicontínuo y continuo. Esta es una clasificación operativa y se aplica a cualquier reactor, sea químico o biológico. En los reactores biológicos el modo de operación define el sistema de cultivo que es el mismo y delimita la clasificación procesal-productiva del bioproceso. Al operar un reactor biológico en una determinada categoría, automáticamente queda determinado el modo de cultivo del sistema y se definen los parámetros y las características operativas y de diseño que intervienen en el proceso productivo del sistema.
Clasificación Biológica:Los biorreactores se clasifican biológicamente de acuerdo al metabolismo procesal del sistema de cultivo: anaeróbico, facultativo, aeróbico. Los bioprocesos de cultivo y las fermentaciones están basados en el metabolismo celular del cultivo. El metabolismo define los parámetros y características operativas-biológicas de diseño y de operación del biorreactor. Estas características son las que intervienen en la parte biológica del sistema y tienen que ver con el crecimiento, productividad y rendimiento del cultivo.
Clasificación Biológica-Operativa:Al conjuntarse las primeras dos clasificaciones, se conjuntan también la función operativa y la biológica para establecer entre ambas un propósito de utilización, el modo de cultivo y el bioproceso. Siendo el propósito de utilización, el destino de cultivo del biorreactor; para qué tipo de cultivo va a ser utilizado el biorreactor; el modo de cultivo es sinónimo de sistema de cultivo y el bioproceso es en sí, todo el proceso.
Tipos de biorreactores.
Existen otros tipos de biorreactores que son muy especiales como lo son:
Ø BIORREACTOR DE ELEVACION CON AIRE.
La falta de un patrón de flujo bien definido en un reactor de tanque con agitación fueconducido a la creación de un reactor basado en el principio del lazo. La cantidad de aire necesario para la reacción biológica usualmente es suficiente para actuar como la única fuente de movimiento del líquido. El aire de proceso se introduce en el fondo del tubo iscendente, en donde la flotación de las burbujas ascendentes ejerce una fuerza de arrastre sobre el fluido circundante que guía el medio por el tubo. En la parte superior, la mayoría de las burbujas se separan y solamente una pequeña porción es transportada hacia el tubo de descenso de manera que en esta región hay sólo un aporte mínimo de oxígeno y poco arrastre hacia arriba. Las ventajas principales de los biorreactores de elevación con aire comparados con los biorreactores de tanque agitado son el corte escaso, requerimientos de energía relativamente bajos y construcción más simples, ya que no se necesitan sellos asépticos alrededor de la flecha del agitador. Las desventajas principales. particularmente a gran escala, son los altos costos de capital, dificultad de esterilización y mayores costos de energía. Aunque los requerimientos de energía son menores, la comprensión de aire para el mezclado y la transportación de la biomasa es menos consciente debido a que el motor del agitador usa energía eléctrica.
Siempre que el flujo debido a la convección exceda el retro mezclado. 54 característica básica del lazo. Sin embargo, tan pronto como no se cumplí miento básico, el sistema debe considerarse como una columna de b retroalimentación y no un sistema de lazo.
Una colocación diferente del tubo de descenso afecta el funcionamiento. El tubo de aspiración interno concéntrico otorga un mezclado adicional repetidos pasajes del medio durante la circulación, el cual se divide en un cuando deja el tubo de aspiración y se une otra vez cuando entra. En tabla algunos datos de mezclado para columnas de burbujeo y brazos lazos de aire de distintos tamaños. Puede verse que para tener una homogeneidad n necesario recorrer seis veces el reactor después de la aplicación de un pulso de kom
En la construcción escala de sistemas de elevación con aire el tiempo de ac aumenta sólo ligeramente con el tamaño debido a que la rapidez de circulado: se puede mantener casi constante. Esto a su vez se debe a que la diferencia de pe la fuerza impulsora causada por la retención de gas aumenta con la altura,en poca fricción con la pared disminuye a medida que aumenta el diámetro. En funcionamiento metabólico de un reactor de elevación con aire no se detiene aumentar la escala.
El biorreactor de elevación con aire ha sido aumentado a escala exi dimensión comercial por ICI (Zannetti, 1984). En este proceso se usa substrato para producir proteína unicelular, SCP, usando methylophilusmeik\ a una capacidad de producción de 60 000 tpa. En Rumania se encuentra ojeaw instalación comercial de SCP, que produce 60 000 tapa de Candidaparafmiczí-naparafinas (Zannatti, 1984). En este proceso se emplean cuatro reactores de coknaa j bujas cada una con una volumen de 1 250 m3.
Ø BIORREACTORES FLUIDIFICADOS.
En la última década se ha registrado un aumento significativo en el numere 3= de reactor de lecho fluidificado los cuales se han usado principalmente pzn, inmovilizadas sobre un material particular, (tabla 14.5). Si la densidad de partículas es mayor que la del agua, el bioneactor se puede disponer como en la figura 14.9 (Atkinson, 1974), en la cual se ajusta un lazo externo a un reactor común. Esto tiene la ventaja de que se puede usar una densidad de partículas mayor y que la velocidad de flujo requerida para la fluidificación se puede alcanzar independientemente del gasto del reactor. Las partículas con menor densidad que la del agua se pueden mantener en suspensión usando el flujo de aire de un reactor aerobio para reducir la densidad del fluido y, por tanto, la flotación de las partículas, como se muestra en la figura 14.10 (Walker y Austin, 1981).
Las principales ventajas de un sistema de bioneactor fluidificado son:
1) características superiores de transferencia de masa y calor;
2) mezclado adecuado entre las tres fases;
3) requerimientos de energía relativamente bajos;
4) bajas velocidades de corte lo cual hace al reactor de lecho fluidificado adecuado para células sensibles al corte tales como células de mamíferos y de plantas.
Ø SISTEMAS DE BIORREACTOR CON MICROPORTADOR.
La mayoría de las células de mamífero necesitan una superficie sólida sobre la cual crezcan. La idea inicial de cultivar células de mamífero dependientes del anclaje sobre microportadores fue concebida por van Wezel (1967), quien empleo una resina de intercambio iónico fragmentada como microportador. Este tipo de resina se usó en lugar de las cuentas de vidrio debido a que su baja densidad permitía velocidades de agitación sienores para mantener las partículas en suspensión. El crecimiento de células sobre perlas zaicroportadoras depende directamente de la superficie disponible para el crecimiento, zasta el punto en que las partículas alcancen concentraciones suficientes para envenenar a üs células y, por lo tanto, reducir su rendimiento. La Toxicidad del soporte puede causar sirgas fases de retardo, la muerte de las células en las primeras etapas de desarrollo y rendimientos celulares limitados. La creación de nuevos soportes microportadores mejora la aplicabilidad y reducirá los efectos tóxicos.
Ø BÍORREACTORES DE MEMBRANA (FIBRA HUECA Y MEMBRANA GIRATORIA)
En sistemas de fibra hueca se han creado y probado para el crecimiento de células pretales y de mamíferos y para la inmovilización de bacterias, levaduras y enzimas. Las fibras huecas se pueden hacer de acetato de celulosa con una matriz de pared uniforme, .polímeros acrílicos o fibras polisulfonadas con figuraciones de pared asimétricas. Estas crisis huecas tienen una superficie altamente porosa de casi 70 um de grosor, en la cual atracanlas células por enlaces y un lumen cilindrico de aproximadamente 200 prn.
2.4. TRANSFERENCIA DE OXÍGENO.
La velocidad de transferencia de 02 desde el seno de la fase gaseosa hasta la fase líquida está determinada por la siguiente ecuación: Ro = Kla (C*- C) donde KLa es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno; C la concentración de 02 disuelto en el seno del líquido y C* la concentración de O2 disuelto en equilibrio con la presión parcial de oxígeno de la fase gaseosa. El KLa y por lo tanto el grado de transferencia de oxígeno desde el seno del líquido hasta las células o microorganismos en cultivo, dependen del diseño del biorreactor y de las condiciones de operación del sistema de cultivo: caudal de aire, volumen del líquido, régimen de agitación, área de transferencia y viscosidad del cultivo. En general, disminuyen el KLa: la viscosidad y el volumen del líquido y aumentan el KLa: el área de transferencia, la agitación y la presencia de dispositivos que aumenten una, la otra, o ambas.
La ecuación de balance de oxígeno en el estado estacionario es: d(VCO2) / dt = F (C – C*) – VrO2 + VNiO2 donde Ni es la velocidad de transferencia de un componente del gas (oxígeno) al líquido (medio). Dado que el oxígeno es el sustrato limitante de la velocidad de crecimiento, cuando el cultivo se encuentra en crecimiento, el flujo de entrada oxígeno (FiO2) será mayor al flujo de salida de oxígeno (FfO2) debido al consumo de oxígeno disuelto en el líquido por parte de las células o microorganismos en crecimiento y/o división celular.
En este caso, la ecuación de balance de oxígeno para células o microorganismos en crecimiento es: d(VCO2) = FiO2C – FfO2C* – VrO2 + VNiO2.
Entrada de aire (21% O2).
La forma más fácil de obtener el oxigeno para el biorreactor es por medio del aire, ya que el aire esta compusto de 21% de oxigeno y además es gratis.
El sistema de aireación externamente comprende las líneas de entrada Fi y salida de aire Ff e internamente debe optimizar la transferencia de gases nutrientes (aire) hacia el medio líquido. Un sistema de aireación consta de cuatro partes mecánicas: fuente de aire; tubería y filtros de entrada; boquilla y difusor de aire; tubería y filtros de salida. Y tres partes de control: control de flujo aire; control de presión de aire; control de difusión de oxígeno disuelto.
El sistema de difusión de oxigeno disuelto debe optimizar al máximo la transferencia de oxígeno disuelto al medio líquido. El sistema consta de dos partes mecánicas: boquilla y difusor de aire; una parte de medición: sensor de oxígeno disuelto y una de control: controlador de oxígeno disuelto.
además de regular el flujo y la presión del aire en la línea o tubería, se debe controlar el valor y la concentración del oxígeno disuelto (OD) dentro del medio líquido; variable que puede medirse en dos formas:
v Oxígeno Disuelto (OD): es la concentración de oxígeno disuelto requerido para la reducción química de un equivalente en iones sulfito (de sodio) a la cantidad de materia orgánica presente en el medio líquido que se debe oxidar.
v Demanda Bioquímica Oxígeno (DBO): es la taza de oxidación biológica o demanda bioquímica de oxígeno disuelto requerida por el microorganismo o célula en cultivo para oxidar la materia orgánica presente en el medio líquido.
La tasa específica de consumo de oxígeno de un cultivo está determinada por la velocidad de transferencia de oxígeno (r02) y el KLa que la correlaciona; recordemos que: rO2 = Kla (C*- C). Se debe conocer la r02 para poder determinar el KLa; el valor de r02 se consigue en la literatura; la concentración de oxígeno disuelto en el líquido (C) es equivalente al valor de OD, e instrumentalmente, se llama: razón de toma de oxigeno (OUR); el equivalente a C* (concentración de oxígeno disuelto en el líquido en equilibrio con el gas) es la demanda bioquímica de oxígeno (DBO) que, instrumentalmente se llama: razón específica de toma de oxigeno: SOUR (specificoxygenuptakerate). Ambas razones pueden medirse, regularse con un controlador OUR/SOUR.
Una probeta o electrodo OD es un sensor que mide la concentración de oxígeno disuelto en el medio líquido. Similarmente, una probeta o electrodo BOD mide la concentración de oxígeno disuelto en el medio líquido en equilibrio con el gas. En ambos casos, el material de su construcción debe ser acero inoxidable y su especificación es por la longitud de inmersión (H) y diámetro (D) de la probeta.
§ MEDICION DE KLA.
El crecimiento de un organismo aerobio en el cultivo sumergido requiere oxigeno disuelto en el medio. El oxígeno debe ser aportado continuamente ya que es escasamente soluble en una solución acuosa. La transferencia de oxígeno del gas hacia los microorganismos se lleva a cabo en varias etapas. Primeramente el oxigeno debe viajar a través del gas hacia la interfase gas-líquido, después a través de la interfase, a través del líquido y, finalmente, hacia el organismo. El proceso completo es impulsado por la diferencia entre la concentración de oxígeno en el gas y en el organismo.
Se ha encontrado que la rapidez de transferencia de oxígeno a bajas concentraciones es proporcional a la diferencia de concentraciones del mismo.Puesto que usualmente es imposible determinar las concentraciones locales en todas las partes de un biorreactor, se debe usar valores promedio de las concentraciones y delos coeficientes de transferencia de masa. Para conocer la rapidez total de transferencia de oxigeno en un recipiente, se tiene que determinar el área superficial total disponiblepara la transferencia de oxígeno. Esta es una cantidad difícil de evaluar, de modo que se usa coeficiente global de transferencia de masa que incorpora el área superficial de las burbujas.
2.5. AGITACIÓN EN LOS REACTORES BIOLÓGICOS.
Ø BIORREACTOR DE TANQUE CON AGITACIÓN
El biorreactor más importante para aplicación industrial es el recipiente para mezclacomún que tiene la doble ventaja de bajo costo de capital y bajos costos de operación. La siguiente figura es un esquema de dicho reactor. Los recipientes para experimentos de la tecnologia son diseñados y fabricados con el propósito de resistir muchas condiciones a las cuales son sometidos para estudiarlas y tratar de manejarse de una manera adecuada a las necesidades de las industria y los procesos donde son emplados los biorreactores.
Entrada de gas. Biorreactor típico de tanque con agitación.
Es rotatorio de hasta de 201 de volumen se hacen de vidrio y para volúmenes mayores su construcción es de acero inoxidable. La relación altura a diámetro del recipiente puede variar entre 2:1 y 6:1 dependiendo en gran medida de la cantidad de calor que será eliminado. El agitador puede ser accionado desde la parte superior o desde la parte inferior. Todos los tanques están provistos con mamparas que evitan la formación de un gran vértice central y mejoran el mezclado. Usualmente se instalan cuatro mamparas con una anchura a diámetro del reactor de 1:10 a 1:12. Si la disipación de calor es un problemacomo puede serlo en biorreactores mayores de 100 m3, se puede usar hasta 12 mamparas y se puede pasar refrigerantes a través de éstas.
- AGITADORES.
Tanto las dispersiones de gas-líquido como las de partícula-líquido en recipientes agitados mecánicamente han sido bien estudiadas. Sin embargo, la suspensión de partículas sólidas con dispersión simultánea de un gas en un líquido, ha recibido menos atención. La finalidad de la agitación en un biorreactor es:
1) dispersar el aire en la solución de nutriente;
2) obtener una temperatura y una concentración de nutriente en todo el recipiente;
3) suspender los microorganismos y nutrientes sólidos;
4) dispersar cualesquiera de los líquidos inmicibles presentes.
Hay tres tipos principales de agitadores que son usados en biorreactores, los cuales se nuestranmas adelante:
1) turbina;
2) impulsor;
3) MIG/INTERMIG.
La turbina de Rushton es el más común de los tres tipos de agitador. Consta de varias paletas sujetas a un eje central. El diámetro de una turbina está normalmente entre el 30 y el 50% del diámetro del tanque y, por lo general, hay entre cuatro a seis paletas. Las turbinas con aspas planas dan un flujo radial, como se muestra en la figura 14.3, lo cual es bueno para dispersar el gas cuando es introducido justo por debajo del impulsor sobre el eje y es llevado hacia las aspas y se rompe en finas burbujas.
Cuando están presentes sólidos, como en una fermentación, se encuentra que es útil un componente axial para mantener los sólidos en suspensión, por lo que se usa una turbina de paletas con un ángulo de paleta de 45°.
Algunos agitadores que podemos observar en los biorreactores:
El agitador propulsor usualmente tiene tres paletas y resuelve a velocidades relativamente altas, 60-300 Hz, para obtener una mezcla efectiva. El patrón de flujo generado, mostrado en la figura 14.3, se denomina flujo axial ya que la corriente fluye axialmente hacia abajo del eje central y hacia arriba sobre los lados del tanque.
Los avances recientes en el diseño de agitadores han conducido a los agitadores MIG e INTERMIG, los cuales requieren 25% y 40%, menos potencia para conseguir el mismo grado de mezcla que un agitador de turbina.
- CARACTERIZACION DE LA AGITACION
Cuando la mezcla es extremadamente compleja, las variables se reúnen en grupos adimensionales para obtener correlaciones que describan al sistema. El número de Reynolds se usa para caracterizar el flujo.
El flujo turbulento se encuentra arriba de un número de Reynolds de 104, en tanto que el flujo laminar ocurre abajo de 100, entre ambos hay una zona de transición. Otro grupo usado para caracterizar la mezcla en un recipiente, el cual toma en cuenta efectos gravitacionales, es el número de Froude.
1) La presencia de sólidos aumentará la viscosidad efectiva, lo cual debe conducir al aumento del tamaño de las burbujas y a la reducción del área interfacial, a.
2) Las partículas pequeflas pueden colectar burbujas en su superficie reduciendo la coalescencia e incrementando el área interfaciala, pero aumentado la resistencia y, por lo tanto, reduciendo kL.
3) Las partículas grandes pueden romper las burbujas incrementado coalescencia y a se reduce, pero kLaumentará. Este efecto dependerá de la susceptibilidad a hidratarse de los sólidos.
La evidencia experimental no es concluyente en cuanto a cuál mecanismo es el que filtróla. Debe quedar establecido que la mayor parte del trabajo sobre agitación con sóidos se ha realizado en sistemas donde los sólidos no son microorganismos y, por lo tanto, I distribución de tamaño y la concentración de las partículas no cambian con el tiempo.
Hay ventajas considerables al usar agitadores con paletas angulares para sistemas de res fases, en que se requiere menos potencia y se puede lograr mayor estabilidad. También se reducirá el corte máximo. Sin embargo, las interacciones con el tubo rociador son muy complejas que con las turbinas de disco y se necesita más trabajo para determinar las bañas óptimas. En la tabla 14.3 se muestra una comparación entre la turbina estándar o agitadores de bombeo hacia arriba y hacia abajo. Puede verse que los agitadores de bombeo hacia arriba suspenden sólidos a menor disipación de energía a bajas tasas de aeración.
Algunos biorreactoresutlizan los motores como agitador dependiendo de la sustancia que aplican al biorreactor.El rendimiento del par del motor para un recipiente de 10 litros es de 1.32W/Nm y la velocidad de agitación está comprendida entre los 20 y 800 r.p.m. El acoplamiento del eje del motor es directo y el sellado es mediante un sello mecánico simple, además el impulsor es de paletas y para el sistema de aireación se utiliza un anillo de aspersión.
Motor de agitación.
2.6. INOCULACIÓN DE REACTORES BIOLÓGICOS.
En microbiología se entiende por siembra la operación que consiste en depositar un germen asépticamente en un medio de cultivo.
Toda siembra debe adaptarse a los siguientes principios generales:
v Practicarla en medios de cultivo favorable y previamente esterilizado.
v Emplear instrumentos asépticos.
v No contaminar ni destruir el inóculo.
v Depositarla asépticamente en los medios elegidos.
v Esterilizar los instrumentos empleados antes y después de cada operación.
El instrumento corrientemente empleado en las siembras es el asa que es un alambre de cromo-níquel, tiene un diámetro de 0,3 a 1 mm.De diámetro y está sujeto a un mango de vidrio o de metal. El hilo puede terminar recto (aguja), en anillo (asa) o aplastado (espátula).
Los medios de cultivo, pueden ser sólidos o líquidos, y estar contenidos en tubos, placas o frascos.La técnica general de las siembras variará según el estado físico del material a sembrar y del medio de cultivo.
Ejemplo de siembra en un medio de cultivo.
Scraag, A. 2002. Biotecnología para ingenieros: sistemas biológicos en procesos tecnológicos. Ed. Limusa.
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