BIOTECNOLOGÍA ENZIMÁTICA E INMOVILIZACIÓN CELULAR.
Enzima.
Enzima
es cualquiera de las numerosas sustancias orgánicas
especializadas compuestas por polímeros de aminoácidos, que actúan como
catalizadores en el metabolismo de los seres vivos. Con su acción, regulan la
velocidad de muchas reacciones químicas implicadas en este proceso.
Una enzima es un
catalizador biológico y, como todos los catalizadores, las enzimas aumentan la
rapidez de una reacción química sin sufrir un cambio químico permanente en sí
mismas. Un catalizador influye en la rapidez de una reacción química pero no
afecta el equilibrio de esta.
Antecedentes.
El primer informe
publicado acerca de la capacidad de los extractos celulares (malta) para llevar
a cabo una reacción característica de las células vivas (la hidrólisis del
almidón a glucosa) fue escrito inicialmente en 1833 por Payen y Persoz.
Se creía que este fenómeno y
otros similares eran reacciones espontáneas hasta que en 1857 el químico
francés Louis Pasteur comprobó que la fermentación sólo ocurre en presencia de
células vivas
El nombre de enzima, que
fue propuesto en 1867 por el fisiólogo alemán Wilhelm Kühne (1837-1900), deriva
de la frase griega en zymē, que significa “en fermento”.
Emil Fischer (1894)
demostró la especificidad de las enzimas para su substrato.
EduardBuchner (1897)
demostró la capacidad de los extractos de levadura para catalizar la conversión
de azúcar a alcohol.
En 1926, el bioquímico
estadounidense James B. Sumner consiguió aislar y cristalizar la ureasa. Cuatro
años después su colega John Howard Northrop aisló y cristalizó la pepsina y la
tripsina. Northrop demostró también la naturaleza proteica de las enzimas.
La ribonucleasa, una enzima
descubierta en 1938 por el bacteriólogo estadounidense René Jules Dubos y
aislada en 1946 por el químico estadounidense MosesKunitz, fue sintetizada por
científicos estadounidenses en 1969.
Propiedades de las enzimas.
Como propuso el químico sueco Jöns Jakob Berzelius en
1823, las enzimas son catalizadores típicos: son capaces de acelerar la
velocidad de reacción sin ser consumidas en el proceso.
Algunas enzimas, como la pepsina y la tripsina, que
intervienen en la hidrólisis de muchos tipos de proteínas, controlan muchas
reacciones diferentes, mientras que otras como la ureasa, son muy específicas y
sólo pueden acelerar una reacción. Otras liberan energía para la contracción
cardiaca y la expansión y contracción de los pulmones. Muchas facilitan la
conversión de azúcar y alimentos en distintas sustancias que el organismo
precisa para la construcción de tejidos, la reposición de células sanguíneas y
la liberación de energía química para mover los músculos.
La especificidad entre el sustrato y la enzima se ha
concebido como la relación de una “llave” y su “cerradura”. La molécula del
sustrato constituye la llave y la proteína constituye la cerradura; en la
superficie de la proteína existe una zona específica, denominada sitio activo o
catalítico, a la cual se une la molécula del sustrato para experimentar la
transformación catalítica.
Las enzimas son muy eficaces. Por ejemplo, unos
30 g de pepsina cristalina pura son capaces de digerir casi dos toneladas
métricas de clara de huevo en pocas horas.
La cinética de las reacciones enzimáticas
difiere de las reacciones inorgánicas simples. Cada enzima es específica de
forma selectiva para la sustancia sobre la que causa la reacción, y es más
eficaz a una temperatura determinada. Aunque un aumento de la temperatura puede
acelerar una reacción, las enzimas son inestables cuando se calientan. La
actividad catalítica de una enzima está determinada sobre todo por su secuencia
de aminoácidos y por la estructura terciaria, es decir, la estructura de
plegamiento tridimensional de la macromolécula.
Poder catalítico.
Es difícil comparar la rapidez de
reacción de las reacciones catalizadas por enzimas con la rapidez de reacción
que ocurre en ausencia de las enzimas bajo condiciones similares de
temperatura, pH, etc. Esto se debe principalmente a las dificultades para medir
las rapideces demasiado bajas de las reacciones no catalizadas por enzimas.
Koshland (1956) informó que las
rapideces de ciertas reacciones eran mucho más altas en presencia de enzimas
que en ausencia de estas. Así, la hexocinasa, fosforilasa, deshidrogenasa
alcohólica y la creatinina cinasa incrementaban las rapideces de reacción en
>1010, >3 x 1011, >2 x 108, y >104,
respectivamente.
Otra característica importante de
las enzimas es su capacidad para funcionar como catalizadores en un intervalo
moderado de temperatura (~ 300 K), pH (2-10) y presión (~ 1 atm).
Un ejemplo es la fijación de
nitrógeno catalizada por el complejo de la enzima nitrogenasa, la cual se
realiza óptimamente a 300 K, pH neutro y presión atmosférica. En contraste, la
síntesis industrial de amoniaco a partir de nitrógeno requiere una temperatura
de 700-900 K, presiones de 100-900 atm y la presencia de fierro como
catalizador.
Alto poder catalítico; se logra
un aumento de hasta 109 a 1012 en la rapidez sobre la
actividad no enzimática.
Especificidad de las enzimas.
La mayoría de las enzimas, a
diferencia de los catalizadores químicos, son altamente específicas en cuanto a
la naturaleza del substrato (s) que utilizan y al tipo de reacción que
catalizan.
Algunas enzimas son más
específicas que otras. Así, las peptidasas, fosfatasas y esterasas utilizaran
una amplia variedad de substratos siempre que éstos contengan el enlace químico
requerido, a saber, enlace peptidico, unión fosfato éster y enlace carboxilato
éster, respectivamente. A menudo, se encuentra baja la especificidad con las
enzimas degradativas, pero rara vez con las enzimas biosintéticas. Otro grupo
de enzimas, por ejemplo, la hexocinasa, son intermedias entre estos dos
extremos que exhiben especificidad de grupo. Así, la hexocinasa cataliza la
fosforilacion de diversos azucares siempre que sean de aldohexosas.
Muchas enzimas muestran
especificidad absoluta en cuyo caso pueden utilizar un solo substrato o un par
de substratos, si la reacción es biomolecular, a una rapidez apreciable.
Ejemplos de estas son las L- y D-lactato deshidrogenasas que catalizan la
reducción de piruvato a L- o D-lactato, respectivamente, pero no la mezcla de
los dos estereoisómeros. Además, estas enzimas son absolutamente específicas en
relación con el compuesto a reducir en la reacción. Por lo tanto, como muchas
enzimas deshidrogenasas, son específicas para NAD o NADP, pero no para ambos.
En tanto que las enzimas
individuales tienen una alta especificidad por su substrato, las enzimas, como un todo, tienen un intervalo amplio de
actividad.
Regulación de la actividad enzimática.
Otra
propiedad importante de las enzimas es que, a diferencia de la catálisis
química, su actividad catalítica a menudo puede regularse mediante iones o
moléculas pequeñas. Así, el Ca2+ estimula a la enzima glucógeno
fosforilasa, responsable del rompimiento del glucógeno a glucosa durante la
contracción muscular.
Un mecanismo
regulatorio que ocurre comúnmente es la inhibición retroalimentada de las
enzimas participantes en vías biosintéticas.
Características
generales.
Cofactores.
Coenzima, moléculas orgánicas
complejas que necesitan algunas enzimas para realizar su actividad. Las
coenzimas pueden estar íntima y permanentemente unidas a las proteínas, o bien
unirse de forma débil y transitoria.
Las
enzimas son proteínas con longitudes de cadena de 100 a 2500 residuos
aminoácidos. Algunas enzimas como la quimotripsina (que cataliza la hidrólisis
de proteínas) y la triosafosfatoisomerasa (que cataliza la interconversión de
gliceraldehído-3-fosfato y dihidroxiacetona fosfato), no requieren de ningún
componente además del substrato para su actividad. Sin embargo, muchas enzimas
requieren de un componente no proteico llamado cofactor para su
actividad.
Un
grupo de cofactores son los iones metálicos. Así, la piruvatocinasa necesita K+
(y Mg2+) para su actividad; la carboxipeptidasa (que hidroliza
proteínas a partir del extremo C-terminal) necesita Zn2+, el cual
forma parte integral de la estructura de la enzima. La eliminación del zinc por
quelación con EDTA desactiva la enzima.
Las cinasas necesitan Mg2+
para su actividad, aunque en este caso el ion metálico se une al substrato en
lugar de la enzima, así, el verdadero substrato es Mg-ATP2- en vez
de ATP.
La
segunda clase principal de cofactores son compuestos orgánicos que con
frecuencia se derivan del grupo de las vitaminas B. Por lo tanto, las
carboxilasas (que incorporan CO2) necesitan la biotina que esta
covalentemente unida a la enzima; las transaminasas requieren fosfato de
piridoxal unido a la enzima.
Los
cofactores que se encuentran fuertemente unidos a la enzima a menudo se
denominan grupos prostéticos. La enzima que contiene el cofactor o grupo
prostético se cono-ce como holoenzima(activa), en tanto que la enzima
que carece del cofactor se denomina apoenzima(inactiva). Compuestos
orgánicos tales como NAD, NADP, FAD, Coenzima A (CoASH) y ATP pueden unirse en
forma lábil a la enzima, un equilibrio entre la enzima, la apoenzima y el
cofactor. Estos cofactores se denominan coenzimas.
Isoenzimas.
Ocasionalmente,
en una sola especie hay varias formas de enzimas que catalizan la misma
reacción. Estas pueden diferir entre sí con respecto a la secuencia de
aminoácidos, alguna modificación covalente como la fosforilación o por cambios
de conformación. Las isoenzimas son aquellas formas de una enzima que provienen
de diferencias determinadas genéticamente en la secuencia de aminoácidos y no
incluyen modificaciones postraduccionales de la secuencia o estructura. Las
enzimas aspartocinasas que participan en el primer paso de la vía biosintética
de la familia del aspartato de los aminoácidos, son ejemplos de isoenzimas.
Ciertas cepas de E. coliposeen tres isoenzimas, cuyas actividades están
sujetas a inhibición por retroalimentación mediante diferentes productos de la
vía.
Clasificación
de las enzimas.
La clasificación de las enzimas
se realiza de acuerdo con el tipo de reacción de transferencia, el grupo dador
y el grupo aceptor, y se reconocen 6 grupos principales: oxidorreductasas
(transferencia de electrones), transferasas (transferencia de grupos),
hidrolasas (reacciones de hidrólisis o transferencia de grupos funcionales al
agua), liasas (adición de grupos a dobles enlaces), isomerasas (transferencia
de grupos en el interior de la molécula para originar formar isoméricas) y
ligasas (forman diversos enlaces acoplados a la ruptura de ATP).
Es común dar a las enzimas
nombres triviales que describen la reacción que catalizan, por ejemplo ureasa
(cataliza la hidrolisis de la urea), lactato deshidrogenasa (cataliza la
oxidación del ácido láctico). En estos casos comúnmente se agrega el sufijo
"-asa" al nombre del substrato o de la reacción catalizada por la
enzima. Sin embargo, con frecuencia los nombres triviales no reflejan la reacción
en la que participa la enzima, por ejemplo, renina, tripsina, enzima málica,
papaína, etc. Como resultado, la EuropeanCommission(Comisión Europea)
dio a conocer una nomenclatura para las enzimas aceptada internacionalmente.
El
nombre sistemático de un enzima consta actualmente de 3 partes:
• el sustrato preferente
• el tipo de reacción realizado
• terminación "asa"
Hay seis tipos principales de
reacciones catalizadas por enzimas:
1)
reacciones de óxido-reducción catalizadas por
óxido-reductasas; Ej.Lactato deshidrogenasa. Nombre sistemático, L-Lactato: NAD+oxidoreductasa
EC 1.1.1.27
2)
reacciones de transferencia de grupo catalizadas
por transferasas; Ej. Hexocinasa. Nombre sistemático, ATP: D-hexosa
6-fosfotransferasa EC 2.7.1.1
3)
reacciones hidroliticas catalizadas por hidrolasas;
Ej. Adenosintrifosfatasa (ATPasa). Nombre sistemático, ATP fosfohidrolasa EC
3.6.1.3
4)
reacciones de eliminación con formación de un
enlace doble, catalizadas por liasas; Ej. Fructuosa-difosfatoaldolasa. Nombre
sistemático, D-fructuosa 1,6 difosfato D-gliceraldehído 3-fosfato-liasa EC
4.2.1.13
5)
reacciones de isomeración catalizadas por
isomerasas; Ej. Triosafosfatoisomerasa. Nombre sistemático, D-gliceraldehído
3-fosfato ceto-isomerasa EC 5.3.1.1
6)
reacciones donde se unen dos moléculas a expensas
de una fuente de energía, generalmente ATP, catalizadas por ligasas (o
sintetasas).Ej. Isoeucil-tRNAsintetasa. Nombre sistemático, L-isoleucina: tRNAIleligasa
(formadora de AMP) EC 6.1.1.5
El
nombre de cada enzima puede ser identificado por un código numérico, encabezado
por las letras EC (enzymecommission), seguidas de cuatro números separados por
puntos. El primer número indica a cual de las seis clases pertenece el enzima,
el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo, el tercero y
el cuarto se refieren a los grupos químicos específicos que intervienen en la
reacción.
Usos prácticos de las enzimas.
La fermentación alcohólica
y otros procesos industriales importantes dependen de la acción de enzimas,
sintetizadas por las levaduras y bacterias empleadas en el proceso de
producción. Algunas enzimas se utilizan con fines médicos. En ocasiones son
útiles en el tratamiento de zonas de inflamación local; la tripsina se emplea
para eliminar sustancias extrañas y tejido muerto de las heridas y quemaduras.
Fuentes de enzimas.
Es obvio que hay tres fuentes de
enzimas: células animales, vegetales y microbianas. En años pasados, las
plantas y los animales fueron las fuentes tradicionales de enzimas, pero dados
los avances recientes de la biotecnología, probablemente el futuro está en los
sistemas microbianos.
Enzimas
de origen animal.
Las enzimas obtenidas a partir de
tejidos animales, por lo general, se preparan de animales recién sacrificados.
Inmediatamente después del sacrificio, se quitan los tejidos y se congelan para
evitar la degradación bioquímica y de sulfuración. Se remueven los tejidos
extraños, particularmente cuerpos grasosos, y a continuación el tejido es
cortado en rebanadas o se pasa a través de un molino de martillos. En algunos
casos la preparación resultante se pasa también por un mezclador para obtener
un puré fino.
|
Enzimas que por lo común se
obtienen de tejidos animales
|
||
|
Enzima
|
Número EC
|
Fuente
|
|
α-amilasa
|
3.2.1.1
|
Páncreas
|
|
Lipasa/esterasa
de ácidos grasos
|
3.1.1.3
|
Páncreas
bovino/porcino
|
|
Lisozima
|
3.2.1.17
|
Albumina
de huevo de bovino
|
|
Fosfolipasa
A
|
3.1.1.4
|
Páncreas
de porcino
|
|
Tripsina
|
3.4.21.4
|
Páncreas
bovino/porcino
|
|
Quimotripsina
|
3.4.21.1
|
Páncreas
bovino/porcino
|
|
Pepsina
|
3.4.23.1
|
Mucosa porcina
|
|
Renina
|
3.4.23.4
|
Bovino
|
Varios tejidos animales se usan
como fuente de enzimas, incluyendo el páncreas, bazo, hígado y varias porciones
del tracto intestinal. Por supuesto, la extracción de la enzima va acompañada
por varios pasos de purificación, los cuales serán tratados con enzimas
microbianas.
Células y
tejidos vegetales.
Por muchos años se han hecho
preparaciones rudimentarias de enzimas vegetales. Sin embargo, la extracción de
enzimas a partir de plantas es a menudo difícil y requiere equipo pesado para
macerar y moler el material típicamente fibroso. Los sistemas de molienda
comunes por lo general son insuficientes, excepto en los casos donde la fuente
de materia es tejido de las hojas y es posible usar molinos de martillos de uso
rudo modificados.
|
Enzimas
que por lo común se obtienen de tejidos animales
|
||
|
Enzima
|
Número
EC
|
Fuente
|
|
β-amilasa
|
3.2.1.2
|
Grano
de cebada
|
|
Peroxidasa
|
1.11.7.7
|
Raíz
de rábano
|
|
Papaína
|
3.4.22.4
|
Látex
del árbol de papaya
|
|
Bromelaína
|
3.4.22.4
|
Bromussp.
|
|
Ficina
|
3.4.22.3
|
Higuera
|
Células
microbianas.
Se acepta generalmente que la
fuente principal de enzimas a escala industrial serán, en el futuro, los
microorganismos. Las razones son:
|
Enzimas microbianas y sus aplicaciones
|
||
|
Enzima
|
Fuente
|
Aplicación
|
|
Amilasa
|
Bacillus
subtilis
Asperyillusoryzae
Penicillumroqueforti
Aspergillusniger
|
Desaprestado de textiles, licuefacción de almidón, producción de
glucosa.
|
|
Pnicinilasa
|
Bacillus
subtilis
|
Degradacíon de penicilina.
|
|
Invertasa
|
Asperyillusoryzae
Saccharomyces
cerevisiae
|
Industria de la confitería
|
|
Celulasa
|
Aspergillusniger
Trichoderma
sp.
|
Disminución de la viscosidad, auxiliares en la
digestión
|
|
Pectinasa
|
Aspergillusniger
|
Clasificación de vinos y jugos de fruta
|
|
Proteasa
|
Clostridumsp.
|
Suavizante, auxiliar en la digestión
|
§ Los
sistemas de producción microbianos pueden mantenerse bajo estrecho control.
§ Las
concentraciones de enzimas y, por lo tanto, la productividad, se pueden
manipular en forma genética y ambiental.
§ El
aumento progresivo y la alimentación del sistema no presentan el mismo problema
logístico que una fuente derivada de la agricultura.
§ Hay un
grado inherente de flexibilidad en el proceso a través de la elección de varias
enzimas.
§ Los
métodos de tamizado para sistemas microbianos son comparativamente simples.
La mayoría de las enzimas
microbianas usadas comercialmente son extracelulares, esto es, se producen en
el interior de las células y luego se excretan o difunden en el medio de
cultivo, del cual pueden ser operados. Esto reduce el problema que se presenta
a menudo con plantas y, algunas veces, con tejidos animales, de tener que
romper las células individuales.
Obviamente, la selección de los
organismos productores es la clave de los resultados satisfactorios de un
proceso de enzimas microbianas. Es necesario tener en cuenta las siguientes
características:
§ Se
requiere un organismo productor estable.
§ Se
requiere un organismo que no presente demasiados problemas de salud y otros
relacionados.
§ Se
requiere un organismo que no demande atención en sus necesidades de
crecimiento, de modo que represente bajos costos de producción.
§ La
productividad enzimática debe ser alta.
§ El
organismo no debe producir toxinas o antibióticos.
§ La
clarificación del medio de cultivo debe estar libre de dificultades mayores.
De todas estas características,
las más importantes son la estabilidad de la cepa y alta productividad
enzimática
Inmovilización de enzimas.
Fundamentos, métodos y aplicaciones.
Aspectos generales sobre la inmovilización de enzimas.
La inmovilización de enzimas es
un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida
del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad
catalítica y
Que pueden ser reutilizadas
repetidamente. Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso
por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de
movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte.
Como ventajas del empleo de
enzimas inmovilizadas podemos destacar:
1.- El aumento de la estabilidad
de la enzima;
2.- La posible reutilización del
derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.
3.- La posibilidad de diseñar un
reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la
enzima inmovilizada.
Los principales inconvenientes
del proceso de inmovilización son:
1.- La alteración de la
conformación de la enzima respecto de su estado nativo.
2.- La gran heterogeneidad del
sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de proteínas
inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte.
4.- El biocatalizador es más caro
que la enzima nativa.
En general, los métodos de
inmovilización se suelen clasificar en dos grandes categorías: 1) Retención
física y 2) Unión química.
Métodos
de inmovilización de enzimas por retención física.
Atrapamiento.
Consiste en la retención física
de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa
constituida generalmente por prepolímerosfotoentrucruzables o polímeros del
tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano.
El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la
enzima en una solución del monómero. Seguidamente se inicia la polimerización
por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico. El
atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que
los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un
gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de
las microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento, de gran sencillez
desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para
obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna
alteración en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un
control riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación
de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la
proteína.
Inclusión en
membranas: Dividida en dos tipos:
1)
Microencapsulación: En esta técnica, las enzimas están rodeadas de
membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y
producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser
permanentes (originadas por polimerización interfacial) o no permanentes
(generadas por surfactantes, también llamadas “micelas reversas”). Las
microcápsulas obtenidas son de forma esférica, con tamaños comprendidos entre 1
y 100 mm de diámetro. Mediante este método se pueden encapsular simultáneamente
una gran variedad de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se lleven
a cabo determinadas reacciones que suceden en múltiples pasos.
2) Reactores de membrana: El
desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas atrapadas ha
despertado gran interés en la industria. Estos reactores emplean membranas
permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente
impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo líquido de
sustrato que atraviesa el reactor.
En general, en esta metodología,
se procede inicialmente a la adsorción de la enzima sobre la membrana que
formará el reactor. Esta adsorción se puede realizar de dos formas:
1. mediante el paso de una solución tamponada de
enzima a través de la membrana;
2. por contacto continuo de una solución de
enzima con la membrana.
Métodos
de inmovilización de enzimas por unión química.
Unión a soportes.
Son los métodos de inmovilización
más utilizados y de los que se dispone de una mayor información. La elección
del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento
posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización incremente
la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplie el intervalo de pH
óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además el soporte
debe tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del
reactor y ser fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser
reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes
para la inmovilización de numerosas enzimas. Estos materiales difieren en
tamaño, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los encontramos en
forma de cilindro, hojas, fibras y más corrientemente en forma de esferas. Los
soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:
Soportes inórganicos. Dentro de
este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que pueden ser naturales
(arcillas como la bentonita, piedra pómez, sílice, etc.) o materiales
manufacturados (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio
no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.)
Soportes orgánicos. Se pueden
clasificar en:
Polímeros naturales: a su vez
divididos en:
Polisacáridos (celulosa, almidón,
dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc).
Proteínas fibrosas (colágeno,
queratina, etc). Polímeros sintéticos: divididos en: Poliolefinas (como el
poliestireno)
Polímeros acrílicos
(poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) Otros tipos (alcohol
polivinílico, poliamidas, etc).
Adsorción.
En la adsorción, la enzima se une
a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones iónicas, fuerzas de Van
der Waals y por puentes de hidrógeno. Los principales factores que influyen en
la adsorción, son:
1.- el pH del medio: controla el
número y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de la proteína
y del sólido;
2.- la fuerza iónica: al aumentar
la fuerza iónica se produce la desorción de la enzima, ya que los iones
inorgánicos se unen con más fuerza al soporte que la proteína;
3.- el diámetro de poro: debe ser
aproximadamente dos veces el tamaño del eje mayor de la enzima;
4.- la presencia de iones que
actúen como cofactores de la enzima, ya que pueden incrementar la carga
enzimática del derivado.
Como principales ventajas de este
método destacan:
1.- su preparación sencilla,
2.- su bajo coste,
3.- no hay cambios de
especificidad enzimática,
4.- los derivados son estables en
medios de trabajo con bajo contenido en agua.
Los inconvenientes de la
adsorción son principalmente:
1.- la optimización de las
variables que controlan la adsorción,
2.- los derivados obtenidos son
poco estables desde el punto de vista mecánico,
3.- la unión al soporte es débil.
Unión covalente.
La unión covalente de una enzima
a un soporte es quizá el método de inmovilización más interesante desde el
punto de vista industrial. La metodología de la unión covalente se basa en la
activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos
de las proteínas. De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en
la estructura de las enzimas, los más empleados para la formación de enlaces
con el soporte son principalmente la lisina, la cisteína, la tirosina y la
histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la arginina y el
ácido aspártico y glutámico. El resto de aminoácidos, debido a su carácter
hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie
proteica, y no pueden intervenir en la unión covalente. Este método presenta
las siguientes ventajas:
1.- La manipulación de los
derivados inmovilizados es sencilla;
2.- La carga de enzima permanece
constante después de la inmovilización;
3.- Los derivados pueden
utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho fluidizado o tanque
agitado.
4.- Una mayor resistencia a la
desactivación por el efecto de la temperatura, de los disolventes orgánicos o
del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria.
En cambio la inmovilización por
enlace covalente también presenta una serie de inconvenientes:
1.- Es necesario conocer la
densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que condiciona el
número de uniones enzima-soporte y su geometría, que puede ser distorsionante y
conducir a derivados inactivos.
2.- El proceso de inmovilización
puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta posible
alteración, se realiza la inmovilización en presencia de un inhibidor que
bloquee el centro activo.
3.- La inmovilización covalente
no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza
iónica, etc.
Reticulado.
También denominado
entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha sido ampliamente
utilizada en la estabilización de muchas enzimas. El método del reticulado
consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones
intermoleculares entre las moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales se
pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio
e, incluso, diaminas si están activadas con carbodiimida. El resultado del
reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de
resistir condiciones extremas de pH y temperatura. El co-reticulado, permite
eliminar las pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos difusionales,
mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad
enzimática y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la albúmina bovina). Un
procedimiento mixto de inmovilización muy común consiste en inmovilizar la
enzima por adsorción sobre una resina de intercambio iónico o un soporte
polimérico (con lo que se consigue una elevada carga enzimática) y
posteriormente añadir el reactivo bifuncional.
Actualmente el método más
novedoso de cross-linking consiste en la cristalización de enzimas y su
posterior reticulado con glutaraldehído (Cross-LinkedEnzymeCrystals o CLECs).
El aumento de estabilidad se basa en la obtención de un entramado cristalino,
donde las moléculas de enzima están rodeadas exclusivamente por otras moléculas
de proteína. De esta manera la propia enzima actúa como soporte, y su
estructura terciaria está estabilizada por las uniones covalentes
intermoleculares. La estructura cristalina posee canales microscópicos (20-50Å)
que permiten el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se
cataliza la reacción. Estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas y
pH extremos, así como la acción de las proteasas. Esta tecnología se ha aplicado
a enzimas muy diferentes, las cuales se han utilizado en la obtención de
compuestos enatioméricamente puros y en la síntesis de péptidos.
Aplicaciones de las enzimas
inmovilizadas.
Las aplicaciones más importantes
de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en:
1.- Aplicaciones analíticas:
biosensores
2.- Aplicaciones médicas:
tratamientos con enzimas inmovilizadas
3.- Aplicaciones industriales: en
la industria química, farmacéutica, alimentaria y de tratamiento de residuos.
Biosensores.
Los biosensores se están
convirtiendo en una herramienta imprescindible en medicina, en el control de
calidad de los alimentos y en el control medioambiental. En principio, se puede
diseñar un biosensor para cualquier tipo de compuesto que sea capaz de
interaccionar específicamente con un sistema biológico. Generalmente, el
biosensor (Figura 5) contiene una molécula biológica inmovilizada (enzimas,
células, anticuerpos) próxima a un traductor que, en contacto con el analito,
transformará la señal química producida en una señal eléctrica o de otro tipo
(óptica, calorimétrica, acústica, etc.).
El empleo de los biosensores presenta
las siguientes ventajas
1. la instrumentación requerida es barata y
sencilla,
2. el análisis es muy sensible,
3. permite el uso de muestras con color o
turbias que no se podrían medir con métodos espectroscópicos.
Aplicaciones médicas.
Existen muchas enfermedades
causadas por una alteración o carencia de una determinada enzima. También hay
enzimas con actividad antitumoral, cicatrizante y con otras acciones
terapéuticas. El tratamiento con estas enzimas inmovilizadas permitiría una
acción más prolongada, ya que serían más resistentes a la acción de las
proteasas. Por ejemplo, la L-asparaginasa se utiliza en el tratamiento de
leucemias y cánceres diseminados que requieren asparragina para desarrollarse.
En la actualidad se ha diseñado un hemodializador de fibra hueca que contiene
asparaginasa inmovilizada. La tripsina o la colagenasa se utilizan para
eliminar los tejidos muertos de heridas, quemaduras, úlceras, etc.; para
acelerar el crecimiento de nuevos tejidos e injertos de piel, y también para
inhibir el crecimiento de algunos microorganismos contaminantes. Este tipo de
enzimas se pueden inmovilizar en celulosas o fibras que formarán parte del
tejido de apósitos y vendas.
Aplicaciones en la Industria
Farmacéutica.
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